La Basilica sorge nel luogo dove, durante il pontificato di Giulio I (337-352) fu istituito un titulus fasciolae a memoria della benda che avvolgeva una caviglia di San Pietro e qui perduta dall’apostolo in fuga verso la via Appia, dopo essere evaso dal carcere Mamertino.

Il titulus assunse successivamente il nome dei Santi martiri Nereo e Achilleo ed è così ricordato, nell’anno 600, in una lettera di San Gregorio Magno.
Alla fine del VIII secolo, durante il pontificato di Leone III (795-816) in luogo del titulus fu edificata una chiesa a pianta basilicale che, poco tempo dopo, a causa dell’insalubrità dei luoghi, fu abbandonata e cadde in rovina. Unica testimonianza superstite della decorazione del tempo di Leone III è il mosaico con l’Annunciazione, la Trasfigurazione e la Theotokos, posto all’esterno dell’arco absidale.

Sisto IV (1471-1484), poco prima dell’Anno Santo, dispose una radicale trasformazione della chiesa e la elevò a titolo cardinalizio. Con l’occasione fu ridotta di dimensioni con l’eliminazione delle prime due campate e, all’interno, sostituendo le colonne di divisione delle campate con pilastri ottagonali in muratura.
Circa un secolo dopo, nel 1597, il cardinale Cesare Baronio della Congregazione dell’Oratorio di Roma, su sollecitazione di Clemente VII (1592-1601), la fece restaurare e decorare. Alla viglia del Giubileo del 1600 nella basilica erano infatti state traslate le reliquie dei Santi martiri Nereo, Achilleo e Domitilla, poste in un’urna ancora oggi situata sotto l’altare maggiore.

Scopo prioritario dell’intero programma decorativo era dunque la glorificazione dei martiri: all’interno della chiesa, a tre navate e con copertura lignea, la narrazione prendeva avvio dalla controfacciata con la scena dell’Annunciazione, l’immagine di papi e martiri e la Trasfigurazione, per proseguire nelle navatelle con le storie dei martiri, rappresentate secondo un’iconografica “controriformata” in cui il supplizio era descritto con particolari raccapriccianti. Nel catino absidale,  ai lati della Croce, erano raffigurati santi e sante con in mano la palmo del martirio.

I due altari laterali erano decorati con pale, tuttora in situ: a destra la Madonna adorata dagli angeli di Durante Alberti e a sinistra i SS. Nereo, Achilleo e Domitilla di Cristoforo Roncalli detto Pomarancio.

Il programma iconografico si estendeva in origine anche sulla facciata esterna della basilica, dove erano affrescati simboli del martirio.